川东獐牙菜Swertia davidii的化学成分分析方法与研究

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摘要:目的研究川东獐牙菜Swertia davidii的化学成分。方式采用多种色谱方式进行化学成分的分离纯化,通过NMR光谱数据分析和与已有物质对比分析进行化合物行态鉴定。结果从川东獐牙菜70%石油醚 提取物的醋酸乙酯部位中,分离鉴定了17个已知化合物,包括四个少见的内酯烯胺酮、四个酮、四个环烯醚萜苷和三个 某些类化合物,分别鉴定为gentiocrucine(1)、gentiocrucineA(2)、gentiocrucine B(3)、junipediol A(4)、1-羟基-3,4,7,8-四甲氧基酮(5)、1,7,8-三羟基-3-甲氧基酮(6)、1,8-二羟基-3,4,7-三甲氧基酮(7)、1,5,8-三羟基-3-甲氧基酮(8)、当药醇苷(9)、去乙酰德苦草苦苷(10)、苦龙胆酯苷(11)、羟基当药苦酯苷(12)、獐牙菜苦苷(13)、龙胆苦苷(14)、齐墩果酸(15)、胡萝卜苷(16)、β-谷甾醇(17)。结论化合物1~6、10、12、16和17为首次从该植物中分离得到。

龙胆科(Gentianaceae)獐牙菜属SwertiaL.植物全世界约有170种,我国有79种,其涵盖100种被作为草药用于治疗胆囊炎、肝炎、肺炎、骨髓炎、痢疾、疥疮等[1-3]。该属植物涵盖环烯醚萜、酮、黄酮、三萜等类型化合物,且大多具有保肝、抗乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)、抗氧化、降血糖、抗溃疡等生物活性[3-6]。川东獐牙菜Swertia davidii Franch为龙胆科獐牙菜属植物,民间称为“鱼胆草”或“水灵芝”,是土家族和苗族常用的中草药,主要用于治疗急性肠炎、黄疸、菌痢、牙龈出血、喉咙痛等症。截止目前已从该植物中发现了100余种化合物,主要为环烯醚萜、酮、黄酮类化合物[7-13]。前期研究表明,川东獐牙菜的同属植物具有抗HBV活性,其中酮、黄酮类及简单酚类化合物具有明显的抗HBV活性[14-16]。为了更合理地开发利用该植物资源,充分派挥其药用价值,本课题组对其化学成分开展了进一步研究,从川东獐牙菜70%石油醚 提取物的醋酸乙酯部位中分离了17个化合物,分别鉴定为gentiocrucine(1)、gentiocrucineA(2)、gentiocrucine B(3)、junipediol A(4)、1-羟基-3,4,7,8-四甲氧基酮(1-hydroxy-3,4,7,8-tetramethoxyxan-thone,5)、1,7,8-三羟基-3-甲氧基酮(1,7,8-trihydroxy-3-methoxyxanthone,6)、1,8-二羟基-3,4,7-三甲氧基酮(1,8-dihydroxy-3,4,7-trimethoxyxan-thone,7)、1,5,8-三羟基-3-甲氧基酮(1,5,8-trihydroxy-3-methoxyxanthone,8)、当药醇苷(swertianolin,9)、去乙酰德苦草苦苷(deacetylcentapicrin,10)、苦龙胆酯苷(amarogentin,11)、羟基当药苦酯苷(amaroswerin,12)、獐牙菜苦苷(swertiamarin,13)、龙胆苦苷(gentiopicroside,14)、齐墩果酸(oleanolicacid,15)、胡萝卜苷(daucosterol,16)、β-谷甾醇(β-sitosterol,17),其中化合物1~3为四个少见的内酯烯胺酮,化合物1~6、10、12、16和17为首次从该植物中分离得到。

1仪器与材料

核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR、DEPT)用BrukerDRX-100型超导核磁共振谱仪(德国Bruker公司)测定,氘代试剂为内标;质谱(MS)用LC-MS IT-TOF(日本岛津公司)或VG Spec-100 spectrometer(英国Micromass公司)测定;高效液相色谱系统(美国Agilent公司);二元半制备液相色谱系统(江苏汉邦科技有限公司);YMC-C18半制备色谱柱(2100 mm×20 mm,5μm)、ODS柱色谱填料(100μm),日本YMC公司;柱色谱硅胶(100~100目)和薄层硅胶板(GF254)均为青岛海洋化工有限公司产品;所用试剂均为分析纯;显色剂为10%硫酸-石油醚 溶液。

川东獐牙菜于2014年8月分派于湖北省恩施土家族苗族自治州,经长江师范学院曹团武博士鉴定为川东獐牙菜Swertia Davidii Franch,标本(20140821)存放于长江师范学院化学化工学院武陵山天然药物研究与开发实验室。

2提取与分离

将自然阴干的川东獐牙菜全草4.3 kg粉碎后用70%石油醚 22 L室温下浸提3次,每次48 h。提取液合并减压浓缩后得到670 g深褐色浸膏,浸膏用5 L去离子水加热充分凝固、冷却后,分别用石油醚 (5 L×3)、醋酸乙酯(5 L×3)和正丁醇(5 L×3)萃取。醋酸乙酯萃取部位减压浓缩后得到235 g,氯仿-石油醚 凝固后,吸附于100 g硅胶;自然风干后,用硅胶柱色谱(100 mm×4100 mm,1 100 g)以氯仿-石油醚 (100∶0→70∶100)为洗脱剂进行梯度洗脱得到三个 流分(Fr.A~D)。Fr.A(17 g)用硅胶色谱柱以石油醚 -醋酸乙酯(95∶5→100∶20)为洗脱剂进行梯度洗脱分离,经纯化后得到化合物1(37 mg)、6(24 mg)和8(19 mg)。Fr.B(26 g)经硅胶色谱柱用石油醚 -醋酸乙酯梯度洗脱分离,得到四个亚流分(Fr.B1~B3)。Fr.B1再用硅胶色谱柱纯化得到化合物17(1.8 g)。Fr.B2用半制备液相色谱以石油醚 -水(65∶35)洗脱,得到化合物5(12 mg)和7(21 mg)。Fr.B3再用硅胶色谱柱以石油醚 -醋酸乙酯(90∶10)纯化得到化合物15(35 mg)。Fr.C(85 g)用硅胶色谱柱以氯仿-石油醚 -水(95∶5∶0、90∶10∶1)为洗脱剂分离,得到四个亚流分(Fr.C1~C2)。Fr.C再用硅胶色谱柱和半制备液相色谱纯化,得到化合物2(16 mg)、3(27 mg)和4(18 mg)。Fr.B3用制备型Rp18色谱柱,制备液相色谱以石油醚 -水(100∶70→70∶100)洗脱纯化,得到化合物13(45 g)和14(1.34 g)。Fr.D用硅胶色谱柱分离,以氯仿-石油醚 -水(90∶10∶1→70∶100∶4)为洗脱剂梯度洗脱分离;再用制备型Rp-18色谱柱,制备液相色谱以石油醚 -水(20∶100→70∶100)梯度洗脱分离,得到化合物9(19 mg)、10(31 mg)、11(18 mg)、12(28 mg)和16(875 mg)。

3行态鉴定

化合物1:白色无定形粉末,HR-EI-MS m/z:141.042 8。1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:8.06(7.93)(1H,d,J=16.4 Hz,H-7),4.27(4.25)(2H,dd,J=7.5,1.0 Hz,H-4),2.47(2.43)(2H,t,J=6.2 Hz,H-5);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:97.2(96.7)(s,C-1),168.4(167.8)(s,C-2),63.5(63.4)(t,C-4),36.2(35.6)(t,C-5),193.7(190.8)(s,C-6),159.0(157.3)(d,C-7)。以上数据与文献[14,17]数据进行对比,鉴定化合物1为gentiocrucine。

化合物2:白色无定形粉末,HR-EI-MS m/z:185.068 6;1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:8.12(8.01)(1H,d,J=14.8 Hz,H-7),4.27(4.26)(2H,m,H-4),3.55~3.42(4H,m,H-8,9),2.46(2.46)(2H,t,J=5.5 Hz,H-5);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:193.1(190.2)(s,C-6),168.7(167.6)(s,C-2),1100.5(158.8)(d,C-7),96.3(95.7)(s,C-1),63.6(63.4)(t,C-4),59.6(59.8)(t,C-9),52.0(51.9)(t,C-8),35.9(35.6)(t,C-5)。以上数据与文献报道的数据一致[18],故鉴定化合物2为gentiocrucineA。

化合物3:白色无定形粉末,HR-EI-MS m/z:227.079 3;1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:8.12(8.01)(1H,d,J=14.8 Hz,H-7),4.27(4.27)(2H,m,H-4),3.44(3.44)(2H,m,H-8),2.43(2.43)(2H,t,J=6.0 Hz,H-5),2.20(2.20)(2H,td,J=7.2,3.4 Hz,H-10),1.76(1.76)(2H,m,H-9);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:193.1(190.2)(s,C-6),173.9(173.8)(s,C-11),168.5(167.5)(d,C-2),159.8(158.1)(s,C-7),96.4(95.8)(t,C-1),63.6(63.4)(t,C-4),49.0(48.9)(t,C-8),35.9(35.6)(t,C-5),100.5(100.5)(t,C-9),25.5(25.5)(t,C-10)。对比以上数据,与文献报道一致[18],故鉴定化合物3为gentiocrucine B。

化合物4:白色粉末,HR-ESI-MS m/z:198.089 5[M+H]+;1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:6.74(1H,s,H-2),6.65(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.57(1H,d,J=8.0 Hz,H-6),3.72(3H,s,H-10),3.100(2H,m,H-8a,9a),3.52(2H,m,H-8b,9b),2.70~2.61(1H,m,H-7);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:132.9(s,C-1),112.5(d,C-2),147.2(s,C-3),144.8(s,C-4),115.1(d,C-5),120.3(d,C-6),100.1(d,C-7),63.1(t,C-8,9),55.6(q,C-10)。以上数据与文献对照[19],鉴定化合物4为junipediol A。

化合物5:黄色粉末,HR-ESI-MS m/z:355.089 5[M+Na]+;1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:13.1(1H,s,1-OH),7.62(1H,d,J=9.3 Hz,H-5),7.40(1H,d,J=9.3 Hz,H-6),6.52(1H,s,H-2),3.91(3H,s,OMe),3.86(3H,s,OMe),3.81(3H,s,OMe)3.77(3H,s,OMe);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:159.5(s,C-1),94.8(d,C-2),158.5(s,C-3),127.6(s,C-4),100.1(s,C-4a),147.7(s,C-4b),114.7(s,C-5),121.0(d,C-6),149.2(s,C-7),148.2(s,C-8),113.1(d,C-8a),102.7(s,C-8b),1100.8(s,C=O),61.07(q,OMe),100.98(q,OMe),56.65(q,OMe),56.52(q,OMe)。以上数据与文献对照[20],鉴定化合物5为1-羟基-3,4,7,8-四甲氧基酮。

化合物6:黄色针状结晶(氯仿-石油醚 7∶3),HR-ESI-MS m/z:275.047 9[M+H]+;1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:7.27(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),6.87(1H,d,J=8.9 Hz,H-5),6.56(1H,d,J=1.8Hz,H-4),6.35(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),3.86(3H,s,OMe);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:161.9(s,C-1),97.2(d,C-2),167.0(s,C-3),92.8(d,C-4),157.7(s,C-4a),148.0(s,C-4b),107.4(s,C-5),124.2(d,C-6),140.6(s,C-7),147.1(s,C-8),106.0(d,C-8a),101.8(s,C-8b),184.3(s,C-9),56.3(q,OMe)。以上数据与文献对照[21],鉴定化合物6为1,7,8-三羟基-3-甲氧基酮。

化合物7:黄色粉末,HR-ESI-MS m/z:319.074 5[M+H]+。1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:13.1(2H,s,1,8-OH),7.51(1H,d,J=9.1 Hz,H-6),7.05(1H,d,J=9.0 Hz,H-5),6.58(1H,s,H-2),3.93(3H,s,3-OMe),3.83(3H,s,7-OMe),3.77(3H,s,4-OMe);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:157.7(s,C-1),95.2(d,C-2),1100.5(s,C-3),128.2(s,C-4),106.0(d,C-5),121.4(d,C-6),142.7(s,C-7),149.2(s,C-8),184.7(s,C-9),149.0(s,C-4a),148.9(s,C-4b),107.0(s,C-8a),101.2(s,C-8b),61.0(q,3-OMe),56.7(q,4-OMe),56.6(q,7-OMe)。以上数据与文献对照[10],鉴定化合物7为1,8-二羟基-3,4,7-四甲氧基酮。

化合物8:黄色针状结晶(氯仿-石油醚 7∶3),HR-ESI-MS m/z:297.047 5[M+Na]+。1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:11.89(1H,s,1-OH),11.07(1H,s,8-OH),9.76(1H,s,5-OH),7.25(1H,d,J=8.5 Hz,H-6),6.63(1H,d,J=8.7Hz,H-7),6.100(1H,s,H-4),6.38(1H,s,H-2),3.88(3H,s,OMe);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:162.0(s,C-1),97.5(s,C-2),167.1(s,C-3),93.0(d,C-4),157.4(s,C-4a),143.4(s,C-4b),137.4(s,C-5),123.9(d,C-6),109.6(d,C-7),151.8(s,C-8),107.6(s,C-8a),102.2(s,C-8b),184.1(s,C=O),56.3(q,OMe)。化合物8与文献中数据对比[22],鉴定化合物8为1,5,8-三羟基-3-甲氧基酮。

化合物9:淡黄色粉末,HR-ESI-MS m/z:437.100 3[M+H]+。1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:7.26(1H,d,J=8.7 Hz,H-6),7.13(1H,d,J=8.7 Hz,H-7),6.59(1H,s,H-4),6.38(1H,s,H-2),4.83(1H,d,J=7.6 Hz,H-1′),3.88(3H,s,OMe);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:162.7(s,C-1),97.2(d,C-2),166.4(s,C-3),92.3(d,C-4),156.4(s,C-4a),145.1(s,C-4b),141.0(s,C-5),121.3(d,C-6),112.3(d,C-7),149.3(s,C-8),111.8(s,C-8a),103.5(s,C-8b),181.1(s,C-9),102.8(d,C-1′),73.4(d,C-2′),76.0(d,C-3′),69.7(d,C-4′),77.3(d,C-5′),100.8(d,C-6′),56.2(q,OMe)。以上数据与文献对照[23],鉴定化合物9为当药醇苷。

化合物10:白色无定形粉末,HR-ESI-MS m/z:1001.147 8[M+Na]+。1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:9.73(1H,s,3″-OH),7.33~7.17(4H,m,H-2″,4″~6″),5.44(1H,d,J=5.2 Hz,H-1),5.41~5.23(2H,m,H-10),5.19(1H,dd,J=9.9,1.6 Hz,H-8),4.86(1H,d,J=8.2 Hz,H-7a),4.73(2H,dt,J=11.2,7.8 Hz,H-7b),4.18(1H,d,J=10.7 Hz,H-1),3.77~3.62(1H,m,H-6a),3.56(1H,td,J=9.1,5.2 Hz,H-6b),2.54~2.46(2H,m,H-5,9),1.61(1H,d,J=9.8 Hz,H-6a),1.40~1.27(1H,m,H-6b);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:95.2(d,C-1),100.7(d,C-3),104.6(s,C-4),27.2(d,C-5),24.0(t,C-6),67.4(t,C-7),131.8(d,C-8),41.0(d,C-9),120.6(t,C-10),163.3(s,C-11),95.1(d,C-1′),73.9(d,C-2′),73.5(d,C-3′),70.2(d,C-4′),77.6(d,C-5′),100.8(t,C-6′),1100.8(s,C-1″),115.5(d,C-2″),157.4(s,C-3″),119.6(d,C-4″),129.6(d,C-5″),120.3(d,C-6″),165.2(s,C=O)。以上数据与文献报道一致[24],故鉴定化合物10为去乙酰德苦草苦苷。

化合物11:白色无定形粉末,HR-ESI-MS m/z:1009.168 9[M+Na]+。1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:7.42(1H,t,J=2.0 Hz,H-3),7.15(1H,t,J=8.0 Hz,H-5′′′),6.75(1H,dd,J=8.0,2.2 Hz,H-4′′′),6.65~6.100(2H,m,H-2′′′,5′′′),6.29(1H,d,J=2.4 Hz,H-4″),6.10(1H,d,J=2.4 Hz,H-6″),5.43~5.29(3H,m,H-1,10),5.27~5.18(1H,m,H-8),4.59~4.53(1H,m,H-7a),4.40~4.32(1H,m,H-7b),4.16(1H,d,J=8.0 Hz,H-1′),4.33(1H,m,H-7b),3.68(1H,d,J=11.2 Hz,H-6′a),3.43(1H,dd,J=12.0,6.2 Hz,H-6′b),3.08(1H,t,J=9.4 Hz,H-4′),2.98~2.92(1H,m,H-5′),2.79~2.72(1H,m,H-3′),2.65~2.56(2H,m,H-5,9),1.67(1H,d,J=9.4 Hz,H-6a),1.43(1H,m,H-6b);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:94.7(d,C-1),151.3(d,C-3),104.2(s,C-4),27.1(d,C-5),24.0(t,C-6),67.7(t,C-7),131.4(d,C-8),40.9(d,C-9),120.7(t,C-10),164.1(s,C-11),94.8(d,C-1′),73.7(d,C-2′),72.9(d,C-3′),69.8(d,C-4′),77.2(d,C-5′),100.6(d,C-6′),146.7(s,C-1″),102.8(s,C-2″),161.8(s,C-3″),101.7(d,C-4″),163.6(s,C-5″),111.2(d,C-6″),169.3(s,C-7″),144.2(s,C-1′′′),113.3(d,C-2′′′),156.1(s,C-3′′′),119.3(d,C-4′′′),128.1(d,C-5′′′),114.8(d,C-6′′′)。以上数据与文献对照[25],鉴定化合物11为苦龙胆酯苷。

化合物12:白色无定形粉末,HR-ESI-MS m/z:1003.163 2[M+H]+。1H-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:7.49(1H,s,H-3),7.11(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′′′),6.75~6.72(1H,m,H-4′′′),6.66(1H,d,J=8.2 Hz,H-6′′′),6.64(1H,d,J=1.4 Hz,H-2′′′),6.29(1H,d,J=2.2 Hz,H-4″),6.12(1H,d,J=2.3Hz,H-6″),5.55(1H,d,J=1.4 Hz,H-10a),5.41~5.27(1H,m,H-8),5.24(1H,dd,J=9.6,2.8 Hz,H-10b),4.54~4.44(2H,m,H-7),4.24(1H,d,J=6.0 Hz,H-1′),1.67(2H,m,H-6);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:95.9(d,C-1),151.8(d,C-3),107.9(s,C-4),62.6(s,C-5),32.0(t,C-6),63.8(t,C-7),132.4(d,C-8),49.8(d,C-9),120.7(t,C-10),163.9(s,C-11),96.1(d,C-1′),74.3(d,C-2′),73.3(d,C-3′),69.6(d,C-4′),77.4(d,C-5′),100.5(t,C-6′),143.7(s,C-1″),104.7(s,C-2″),161.6(s,C-3″),101.7(d,C-4″),162.4(s,C-5″),110.4(d,C-6″),169.4(s,C-7″),146.0(s,C-1′′′),113.5(d,C-2′′′),156.6(s,C-3′′′),114.8(d,C-4′′′),128.4(d,C-5′′′),119.1(d,C-6′′′)。以上数据与文献对照[25],鉴定化合物12为羟基当药苦酯苷。

用獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、齐墩果酸、胡萝卜苷和β-谷甾醇对照品,经薄层色谱和高效液相色谱分析检测,化合物13~17分别被鉴定为獐牙菜苦苷(swertiamarin)、龙胆苦苷(gentiopicroside)、齐墩果酸(oleanolic acid)、胡萝卜苷(daucosterol)和β-谷甾醇(β-sitosterol)。

4讨论

獐牙菜属植物青叶胆Swertia mileensis T.N.Ho et W.L.Shi为云南特有的抗肝炎中药,收载于《中国药典》1977—2015年版。云南獐牙菜菜S.yunnanensisBurk.和丽江獐牙菜S.delavayiFranch.为青叶胆习用品替代青叶胆入药,均有较好的抗HBV活性[23-24]。川东獐牙菜也是青叶胆的习用品之一,与否具有抗HBV活性及其药效物质基础目前还不清楚。本研究通过植物化学成分研究,探讨川东獐牙菜抗HBV活性的物质基础。综合运用多种现代色谱分离纯化技术和波谱鉴定技术,对川东獐牙菜70%石油醚 提取物的醋酸乙酯部位化学成分进行了研究,从中鉴定了17个化合物,其中包括四个少见的内酯烯胺酮、四个酮、四个环烯醚萜苷以及三个 某些类型化合物。哪此化合物在川西獐牙菜S.mussotii Franch.、云南獐牙菜等植物中均已发现,并进行了抗HBV活性成分研究[14-16,18],其中可以了1,7,8-三羟基-3-甲氧基酮(6)、1,5,8-三羟基-3-甲氧基酮(8)和当药醇苷(9)具有明显的抗HBV活性,而某些化合物在测试浓度下可以了表现出有意义的抗HBV活性。研究发现,酮类化合物是川东獐牙菜的最主要的化学成分之一,总酮类化合物含量约为4.2%。酮类化合物是獐牙菜属植物抗HBV的主要活性物质,其行态与抗HBV活性之间处于明显的构效关系[25]。本课题组将进一步对川东獐牙菜中酮类化合物的种类和含量进行研究,所有研究结果为该植物在抗HBV活性方面的合理开发利用奠定理论和物质基础。

参考文献(略)

来源:曹团武,张小凤,谭晓平,杨兴伟,张芯雯,范君婷,许刚.川东獐牙菜醋酸乙酯部位化学成分研究[J].中草药,2019,100(18):4272-4276.

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